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聚合酶链式反应(PCR)

操作步骤

1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

1QPCR buffer

5 μl

dNTP mix( 2mM )

4 μl

引物1(10pM)

μl 2

引物2 ( 10pM)

2μl

Taq酶(2U/ul)

1 μl

DNA模板( 50ng-1μg/μl )

1 μl

加ddH2O至

μl 50

视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。

2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上执行扩增。-般:在93°C

预变性3-5min ,进入循环扩增阶段: 93°C 40s→58°C 30s→72°C 60s ,循环30-35

次，后在72°C保温7min。

3.结束反应, PCR产物放置于4°C待电泳检测或-20°C长期保存。

4. PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100ul进行抽提反应混合液,以

除去石蜡油;否则,直接取5- 10μl电泳检测。

RNA pull down 检测

RNA pull down：RNA沉淀检测，是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验方法之一。使用体外转录将RNA进行生物素标记，并与细胞蛋白裂解液孵育，形成RNA-蛋白复合物。复合物通过磁珠结合后分离，复合物纯化洗脱后通过Western blot验证检测特性的蛋白。若筛选可能结合的蛋白通过质谱实验进行检测筛选。腺相关病毒具有gan染温和,免yi原性小,长效稳定表达的特点,主要应用于动物体内注射。

注意事项

1. 为了避免蛋白质变性，不要对样品剧烈搅动和反复冻融。

2. 缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环。。

3. 为了避免蛋白质的氧化，将 0.1～1 mmol/LDTT（二硫苏糖醇）(或 β-巯）加入到缓冲溶液中。

4. 为了避免重金属对目标蛋白的破坏，将 1～10 mmol/LEDTA 金属螯合剂加入。

5. 为了避免微生物生长，使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质的时候，均必须时刻对它的稳定性注意维护，使它的活性得到保护，需要牢记如下一些通用的注意事项。

6. 尽可能置于冰上或者在冷库内进行操作。

7. 蛋白浓度不要太稀。

8. 除非是进行聚焦层。否则 pH 需要合适，防止所使用的缓冲溶液 pH 与 pI 相同，使蛋白质的沉淀得以避免。

9. 使用蛋白酶，避免蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，将 DNA 酶加入来使得 DNA 降解，避免 DNA 对蛋白的污染。

5.长可以合成多长的引物？

答：引物越长，出现问题的概率就越大。有的公司合成过120base的引物，产率很低。去除rRNA的链特异性文库，含有的RNA信息含量十分丰富，通过测序和生物信息学分析能够得到mRNA、lncRNA、circRNA的鉴定及注释信息。除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer，按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，的产量很低。

6.需要合成多少OD数？

答：根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD。做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。大部分线粒体基因由于其母系遗传特性以及进化速率较快等特点，被广泛地用于种群遗传学、进化生物学、谱系地理学和系统发育学、疾病诊断等学科领域。片段越长, 全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。